PCR的假阳性问题深受重视，但PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。就PCR假阳性的问题来说，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，大三阳检出率低、甚至检测PCR仍为阴性的事情也经常发生，可见假阴性问题的严重性。
就PCR假阴性问题总体来说有如下因素：
一、 仪器因素
PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差，引起扩增失败可扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），所以在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因基他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
二、 试剂质量问题
PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Taq酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
三、 核酸模板问题
核酸模板质量问题是制约PCR重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附、空间位阻等模板质量问题都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。由于无论什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关，但它不可能由试剂质量完全解决。
核酸模板问题除了模板本身的问题外，还存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分（如某些蛋白、离子等）作用，而导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。对此，有人提倡进行模板纯化，效果较为明显。但另一个问题又出现了，那就是怎样保证纯化的回收率问题。总之，核酸模板问题是不可避免的问题，只能努力去减少。
四、 操作人员素质问题
PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误、对于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作人员有很好的素质，能够严格遵守操作规程，并能敏锐的发现问题和解决问题。
五、 其他
PCR实验中从样品的采集、运输、保存开始就可以引起结果的假阴性，而对于病原体检测（如HBV）在人体血液系统出现有周期性变化也是值得注意的因素。
PCR反应的特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
污染原因
一、标本间交叉污染：
标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；病毒样本可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
二、PCR试剂的污染：
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
三、PCR扩增产物污染：
这是PCR反应中主要常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的检出限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。
还有一种容易忽视，可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染。在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
四、实验室中克隆质粒的污染：
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照或其他阳性样品的检验室，这个问题也比较常见，其污染可能性也很大。
污染的监测
一个好的PCR实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
对照试验：
一、阳性对照：
建立PCR实验室都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设强阳性对照，以弱阳性对照能为可能的低浓度病毒样本把关。另外，条件成熟的实验室应选用第三方如卫生部临检中心提供的室内质控品阳性参考品来监测整个反应体系。
二、阴性对照：
以已知阴性血清为阴性对照，有条件的实验室应选用第三方如卫生部临检中心提供的室内质控品阴性参考品来监测整个反应体系。
三、重复性试验。
防止污染的方法
一、 污染的预防
进行PCR操作时，操作人员应该严格遵一些操作规程，程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。
1.划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：
(1)试剂准备区，包括反应液的配制和试剂耗材的储存等。
(2)标本处理区，包括标本的接收、处理以及扩增摸板的制备。
(3)扩增检测区，包括PCR扩增检测、结果分析和报告的发放。
(4)各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。实验室人员和物品的工作流向应为试剂耗材储存和准备区→标本处理混样区→样本制备（核酸纯化）区→扩增检测区，不得逆向流动。
(5)实验用品包括实验材料（试剂、标本和耗材等）、实验器材（包括容器、板架、实验服、帽子、口罩、手套、鞋套等）、办公用品（各类文件、记录纸、笔等）以及清洁用具等，为便于鉴别，不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。
(6)清洁方法不当也是污染发生的一个重要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增检测区的方向进行。不同的实验区域应使用其各自的清洁用具以防止交叉污染。
2.分装和配置试剂：核酸提取PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台（生物安全柜）配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中。
3. 实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、提取和扩增的所有环节都应该注意：
(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液或血清样本，应立即更换手套。
(2)使用一次性带滤芯吸头，严禁与PCR各区的吸头混用，吸头使用完毕后应立即闭盖，不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。
(3)避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用10%次氯酸钠擦拭桌面。
(4)操作多份样品时，应事先做好标记，然后开始操作，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。
(5加入样本的反应管应配上盖子并盖紧。
(6)操作时设立阴阳性对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。
(7)尽可能使用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器容易受产物气溶胶或标本核酸的污染，好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用。
(8)遇疑似样本，进行确认实验时应做重复或副孔实验，验证结果，慎下结论。
4.进行血液核酸检测的人员须具有血液核酸检测的培训合格证书，并接受过实验室生物安全以及厂家的上岗前仪器设备操作、维护及校准等的培训。
5.对实验室外来人员的控制，凡进入实验室的人员，不论是参观人员、进修人员、施工工人等皆须遵守实验室规定，严格着装防护服，并严格遵守实验室流向制度。
6每一个核酸检测实验室人员要具有区别于日常实验的强防污染意识。
二、污染源追踪
如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。
1.试剂污染：
设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上逐一处理。
2.环境污染：
在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。环境污染中常见的污染源主要有：
(1)核酸混样及提取设备
(2)生物安全柜
(3)离心机
(4)冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等。此时可用擦拭实验来查找可疑污染源：
(5)气溶胶。
如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该彻底清洁实验室或更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。
三、污染处理
1.环境污染
(1)稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤。
(2)紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。
2.反应液污染
可采用下列方法之一处理：
(1)DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。
(2)内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR。
(3)紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。
(4)g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。
3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
(1)原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT.这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
(2)dUTP法：用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU.在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
(3)dU引物法：合成引物时以dU 代dT,这样PCR产物中仅5ˊ端带dU.UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
(4)优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
(5)需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
4、日常的去污染措施包括但不仅限下面几种：
（1）用10%次氯酸钠或75%乙醇清洁表面，包括实验操作台（每日）、储存冰箱（每周至少一次）、仪器表面（每日）等；
（2）试验后长时间的紫外照射实验操作台面和其他表面；1小时的移动紫外车60-90CM照射台面，4小时以上的固定紫外灯屋内照射；
（3）可高压的加样器的高压消毒；对剪刀、镊子等用品的消毒（每周一次）；
（4）实验室通风2小时以上（每日实验后），窗户必须配置纱窗。
实验室发生核酸残余污染的处理及验证原则
1． 终止实验：
一旦发生污染后，围绕实验室寻找污染源耗时且很繁琐，所以防止污染重在预防。但如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源并清除污染为止，并且实验结果必须作废。
2． 污染清除的验证：
可从核酸提取开始，按程序分步检测15-20份纯水样本，观察是否有阳性反应结果的出现。如有，则说明实验室仍有污染存在，必须清洁至所有水样本均检测为阴性，实验室才可重新启用。
总体来说，影响实验结果大的因素也就是试剂、环境、设备、人员，其中人员具有大的可变性。结合对长期以来的实验数据整理和质控图的分析，多发现问题，解决问题，凡是好的我们肯定会继续坚持，不好的习惯坚决摒弃，只有以认真的工作态度、以谨慎的操作来完成每日的正常检测实验，杜绝或减少假阳性的发生，才能保证血筛实验的正常开展。
